KUMAIN Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Kamakailan ay ipinakita na ang ascomycete fungus na Ilyonectria crassa ay may kakayahang makahawa sa mga tubers ng patatas. Ang gawaing ito ang unang pinag-aaralan ang mga biological na katangian at paglaban sa ilang mga fungicide ng I. crassa strain na ihiwalay mula sa patatas. Ang mga pagkakasunud-sunod ng mga rehiyon na tukoy sa species ng "patatas" na pinagmanahan ay sumabay sa mga nakuha nang mas maaga para sa mga fungi na nakahiwalay mula sa mga ugat ng narcissus, ginseng, aspen at beech, mga liryo at mga dahon ng tulip. Tila, maraming mga ligaw at hardin na halaman ay maaaring maging taglay ng I. crassa. Ang inimbestigahan na pilay ay nahawahan ang mga hiwa ng kamatis at patatas, ngunit hindi nahawahan ang buong prutas ng kamatis at buo na tubo ng patatas. Ipinapakita nito na ang I. crassa ay isang sugat na parasito. Ang pagsusuri ng paglaban sa fludioxonil, difenoconazole at azoxystrobin sa isang medium na nakapagpapalusog ay nagpakita ng mataas na espiritu ng mga gamot na ito.
Ang tagapagpahiwatig ng EC50 (ang konsentrasyon ng fungicide, na nagpapabagal ng 2 beses sa rate ng paglaki ng radial ng kolonya na may kaugnayan sa kontrol na hindi fungicidal) ay katumbas ng 0.4; 7.4 at 4 mg / l, ayon sa pagkakabanggit. Ang posibilidad ng pagbuo ng isang sakit na sanhi ng I. crassa ay dapat isaalang-alang kapag ang pagsusuri ng fittopathological ng mga tubers ng patatas at pag-unlad ng mga hakbang sa proteksyon ng halaman.
Ang pagpapaunlad ng mga fitopathogenic microorganism ay humahantong sa mataas na pagkalugi sa lahat ng mga yugto ng pagtatanim at pag-iimbak ng patatas. Kapag nagpaplano ng mga panukalang proteksiyon, bilang panuntunan, isinasaalang-alang ang mga kilalang pathogens, tulad ng mga species ng genera na Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, atbp. Gayunpaman, sa mga nagdaang taon, maraming mga ulat ang lumitaw tungkol sa paglitaw ng mga bagong phytopathogenic microorganism sa patatas. Ang kanilang biology ay hindi mahusay na pinag-aralan, ang pagiging epektibo ng mga fungicide na ginamit sa patatas na may kaugnayan sa mga ito ay hindi kilala, ang mga diagnostic na pamamaraan ay hindi pa nabuo. Sa pag-unlad ng masa, may kakayahang magdulot ng malaking pinsala sa ani ng patatas. Ang isa sa mga mikroorganismo na ito ay ang ascomycete fungus Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, unang natuklasan ng mga may-akda sa mga patatas na tubers (Chudinova et al., 2019).
Ipinapakita ng gawaing ito ang mga resulta ng pagsusuri ng I. crassa strain na nakahiwalay sa tubo ng patatas. Pinag-aralan ang morpolohiya ng mga kolonya at istraktura ng mycelial ng I. crassa, mga pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide ng mga rehiyon na tukoy sa species ng DNA, kahinahunan sa patatas at kamatis, at paglaban sa ilang mga tanyag na fungicide.
Mga materyales at pamamaraan
Ginamit namin ang I. crassa 18KSuPT2 strain na nakahiwalay sa 2018 mula sa nahawahan na tubo ng patatas na lumaki sa rehiyon ng Kostroma. Ang tuber ay naapektuhan ng dry rot na may isang lukab na natatakpan ng light brown mycelium. Gamit ang isang sterile na karayom ng dissecting, ang fungal mycelium ay inilipat sa isang ulam na Petri na may isang medium ng agar (beer wort 10%, agar 1.5%, penicillin 1000 U / ml). Ang mga plato ay nakapaloob sa kadiliman sa 24 ° C.
Ang isang Leica DM2500 light microscope na may ICC50 HD digital camera at isang Leica M80 binocular microscope na may isang IC80HD digital camera (Leica Microsystems, Germany) ay ginamit upang kunan ng larawan, suriin ang laki at morpolohiya ng mga spore at spore organ.
Upang ihiwalay ang DNA, ang fungal mycelium ay lumago sa likidong gisantes ng gisantes, pagkatapos ay na-freeze sa likidong nitrogen, homogenized, incubated sa CTAB buffer, pinadalisay ng chloroform, at hinugasan ng dalawang beses sa 2% na alkohol.
Ang pamamaraan ng pagkuha ng DNA ay inilarawan nang detalyado sa artikulo ni Kutuzova et al. (2017).
Upang matukoy ang species sa pamamagitan ng mga pamamaraang molekular at ihambing sa iba pang mga kilalang I. crassa strains, ang PCR ay ginampanan ng mga primer na nagpapahintulot sa pagpapalaki ng mga rehiyon na partikular sa species ng DNA: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5 / ITS4, White et al., 1990 ), mga rehiyon ng b Ang mga Amplicon ng nais na haba ay nakuha mula sa gel gamit ang Evrogen CleanUp kit. Ang pinalakas na mga rehiyon ay sumunud-sunod gamit ang BigDye® Terminator v2 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) sa isang Applied Biosystems 2 xl automated sequencer (Applied Biosystems, CA, USA). Ang nakuha na mga pagkakasunud-sunod ng nucleotide ay ginamit upang maghanap ng isang tugma sa database ng GenBank ng US National Center for Biotechnology Information (NCBI). Ang pagsusuri ng phylogenetic ay isinagawa gamit ang programang MEGA 1995 (Tamura et al., 1).
Ang pagtukoy ng kabutihan ay isinasagawa sa buong berdeng prutas ng malalaking prutas na kamatis (iba't ibang Dubrava) at mga patatas na tubers (iba't ibang Gala). Bilang karagdagan, ang mga hiwa ng parehong prutas at tubers ay ginamit upang gayahin ang pinsala sa mga nasirang prutas at tubers. Ang mga hiwa ng tubers ay inilagay sa mga basa na silid, na kung saan ay ang mga pinggan ng Petri na may basang pansala na papel sa ilalim. Ang isang slide ay inilagay sa papel, kung saan, sa turn, mga hiwa ng tubers o prutas ay inilagay. Ang buong tubers at prutas ay inilagay din sa mga lalagyan na may basang pansala na papel sa ilalim. Sa gitna ng hiwa (o sa buo na ibabaw ng tuber o prutas), isang piraso ng agar (5 × 5 mm) na may fungal hyphae ay inilagay pagkatapos ng 5 araw na lumalagong sa wort agar.
Ang pagsusuri ng paglaban ng mga fungal strain sa fungicides ay isinasagawa sa mga kondisyon ng laboratoryo sa medium ng nutrient ng agar. Pinag-aralan namin ang pagkamaramdamin sa mga fungicidal na gamot na Maxim, KS (aktibong sangkap na fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Katalogo ng estado ..., 2020 ). Isinasagawa ang pagsusuri sa mga pinggan ng Petri sa wort-agar medium na may pagdaragdag ng mga pinag-aralan na gamot sa konsentrasyon ng aktibong sangkap na 0.1; isa; 1 ppm (mg / L) (para sa fludioxonil at difenoconazole), 10; sampu; 1 ppm (para sa azoxystrobin) at sa media na walang fungicide (control). Ang fungicide ay idinagdag sa natutunaw na daluyan na pinalamig sa 10 ° C, pagkatapos na ang medium ay ibinuhos sa mga pinggan ng Petri. Ang isang agar block na may fungal mycelium ay inilagay sa gitna ng isang ulam ng Petri at nilinang sa temperatura na 100 ° C sa dilim. Pagkatapos ng 60 araw ng pagpapapisa ng itlog, ang mga diameter ng mga kolonya ay sinusukat sa dalawang magkatulad na patayong direksyon; ang mga resulta sa pagsukat para sa bawat kolonya ay na-average. Ang mga eksperimento ay isinagawa sa triplicate. Batay sa mga resulta ng mga pag-aaral, ang EC24 ay kinakalkula, katumbas ng konsentrasyon ng fungicide, na hinati ang rate ng paglaki ng radial ng kolonya na may kaugnayan sa fungicidal control.
resulta at diskusyon
Sa mga pinggan ng petri na may wort agar, ang fungus ay bumuo ng mga kolonya na may puting flocculent mycelium. Ang daluyan sa ilalim ng mycelium ay namula-kayumanggi. Kapag natutuyo ang daluyan, ang fungus ay bumuo ng mga spore ng dalawang uri sa solong at pinagsama-sama na mga conidiophore sa maliit na sporodochia. Ang Macroconidia ay pinahaba, cylindrical, na may isa hanggang tatlong septa, average na haba 27.2 µm na may isang saklaw ng mga halaga mula 23.2 hanggang 32.2 µm, lapad hanggang sa 4.9 µm (Larawan 1). Ang average na haba ng microconidia ay 14.3 µm na may isang saklaw ng mga halaga mula 10.3 hanggang 18.1 µm, at ang lapad ay hanggang sa 4.0 µm. Ang lahat ng mga character na macro- at micromorphological ay umaangkop sa saklaw ng pagkakaiba-iba ng species na Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Ang mga pagkakasunud-sunod ng mga rehiyon na tukoy sa species ng DNA (ITS, b-tubulin, TEF 1α) ay ganap na sumabay sa mga pagkakasunud-sunod ng mga I. crassa na pinag-aralan namin nang mas maaga (Chudinova et al., 2019, Talaan 1). Upang mapag-aralan ang pagkalat ng I. crassa sa iba pang mga rehiyon at upang pag-aralan ang spectrum ng mga apektadong kultura, sinuri ang mga katulad na pagkakasunud-sunod ng DNA sa database ng GenBank (Talahanayan 1). Ang overlap ay 86 hanggang 100%. Ang mga pagkakasunud-sunod ng lahat ng tatlong mga rehiyon ng DNA ng "patatas" na I. crassa strain ay magkapareho sa mga pagkakasunud-sunod ng mga strain na ihiwalay mula sa mga bombilya ng liryo at daffodil sa Netherlands at mula sa ugat ng ginseng sa Canada. Hindi namin mahanap ang iba pang mga I. crassa strain na may tatlong nasuri na magkatulad na pagkakasunud-sunod sa mga bukas na database. Gayunpaman, ang pagtatasa ng idineposito na mga pagkakasunud-sunod ng ITS at b-tubulin ay nagpakita ng pagkakaroon ng I. crassa sa mga dahon ng tulip sa UK. Ang mga fungus na may katulad na pagkakasunud-sunod ng ITS ay nakilala kapag pinag-aaralan ang mycobiota ng mga aspen root sa Canada at beech Roots sa Italya, at mga patatas na tuber sa Saudi Arabia (Talaan 1). Ang mga resulta ng pag-aaral na ito ay nagpapakita na ang I. crassa ay mayroong pandaigdigang pamamahagi at may kakayahang mahawahan ang iba`t ibang mga species ng halaman.
Kapag tinutukoy ang pathogenicity sa mga hiwa ng kamatis at patatas sa ika-5 araw, ang diameter ng sugat ay umabot sa 1.5 cm. Sa parehong oras, ang inimbestigahan na pilay ay hindi nakakaapekto sa buong prutas ng kamatis at buo na tubo ng patatas. Gayunpaman, ang mga sepal ay naapektuhan sa kamatis. Upang maibukod ang posibilidad ng kontaminasyon, ang isang fungal ihiwalay mula sa mycelium na binuo sa isang patatas na hiwa ng tuber ay naihiwalay sa isang purong kultura. Ito ay ganap na magkapareho sa pilay ng magulang. Tila, si I. crassa ay isang sugat na parasito.
Ang paggamot bago ang pagtatanim ng mga tubers ng binhi na may fungicides ay binabawasan ang pag-unlad ng mga sakit sa mga halaman sa lumalagong panahon. Para sa pagpili ng mabisang fungicides, mahalagang suriin kung alin sa mga ito ang mabisa laban sa I. сrassa. Pinag-aralan ng trabaho ang laganap na mga aktibong sangkap ng fungicides - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Ang Fludioxonil ay binubuo sa maraming mga mixture na ginamit para sa pagbibihis ng mga binhi at tubo ng binhi bago itanim. Ginagamit din ang Fludioxonil (Maxim) upang gamutin ang mga tubers ng binhi bago itago. Ang Difenoconazole at azoxystrobin ay kasama rin sa isang bilang ng mga paghahanda na ginamit para sa pagpoproseso ng materyal ng binhi, pati na rin sa mga paghahanda na inilaan para sa pagpoproseso ng mga halaman na halaman (State catalog ..., 2020).
Ang rate ng paglago ng I. crassa ay pinag-aralan sa media (Larawan 2) na may iba't ibang mga konsentrasyon ng mga aktibong sangkap: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm), at difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Talahanayan 2 ). Ang mga paghahanda na ito ay maaaring isaalang-alang na lubos na epektibo laban sa I. crassa, dahil ang kanilang EC50 ay makabuluhang mas mababa kaysa sa inirekumendang konsentrasyon ng paghahanda sa gumaganang likido na ginagamit para sa paggamot sa mga tubers. Ayon sa State Catalog ... (2020), ang konsentrasyon ng fludioxonil sa likido para sa paggamot ng mga patatas na tubers ay mula 500 hanggang 1000 ppm, azoxystrobin (sa likido para sa pagpapagamot sa ilalim ng tudling) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (sa likido para sa pagpapagamot ng mga halaman na hindi halaman) - 187.5-625 ppm.
Talahanayan 1. Pagkakapareho ng mga pagkakasunud-sunod ng mga species-tukoy na pagkakasunud-sunod ng pilay 18KSuPT2 at mga strain ng Ilyonectria crassa na magagamit sa Genbank database
Pilitin | Halaman ng host, lugar ng paglabas | Ang mga numero ng pagkakasunud-sunod na idineposito sa GenBank, porsyento ng mga pagkakatulad | Link | ||
NITO | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 at 18KSuPT2 | Potato tuber, rehiyon ng Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, ang gawaing ito |
CBS 158/31 | Mga ugat ng Narcissus, Netherlands | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Lily bombilya, Netherlands | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng root, Canada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulip leaf, UK | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Mga ugat ng Aspen, Canada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Beech, Italya | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Direktang pagsusumite |
KAUF19 | Potato tuber, Saudi Arabia | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = hindi idineposito
Talahanayan 2. Paglaban ng Ilyonectria crassa sa fungicides
(aktibong sangkap) | EC50, ppm | ||||
3 araw | 5 araw | 7 araw | |||
Kontrolin | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazole) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Sa aming trabaho, ang mga I. crassa strains ay ihiwalay mula sa mga tubo ng patatas sa mga rehiyon ng Kostroma at Moscow (Chudinova et al., 2019). Ang isang mataas na proporsyon ng mga fungal strain na may mga pagkakasunud-sunod ng ITS na magkapareho sa I. crassa ay isiniwalat sa pagtatasa ng mycobiota ng mga patatas na tubers sa Saudi Arabia (Gashgari at Gherbawy, 2013). Tila, ang I. crassa ay hindi gaanong bihirang sa patatas na maaaring mukhang. Sa aming mga eksperimento, ipinakita na ang fungus ay maaaring makahawa sa mga nasirang prutas ng kamatis. Alam mula sa panitikan na ang I. crassa ay may kakayahang bumuo ng saprotrophically sa lupa (Moll et al., 2016), pati na rin ang nakakaapekto sa iba't ibang mga halaman, kahit na malayo sa taxonomically tulad ng daffodil, lily, ginseng, aspen, at beech (Talahanayan 1). isa). Tila, maraming mga ligaw at hardin na halaman ay maaaring maging taglay ng I. crassa. Ipinapakita sa itaas na kapag nagkakaroon ng mga hakbang sa proteksyon, kinakailangang isaalang-alang ang posibilidad na maapektuhan ang mga tubers ng patatas sa fungus na ito. Ang malawakang paghahanda para sa paggamot ng mga tubo ng patatas na naglalaman ng fludioxonil, azoxystrobin at difenoconazole ay nagpakita ng mataas na fungicidal efficacy laban sa I. crassa.
Ang gawaing ito ay suportado ng Russian Foundation for Basic Research (Grant No. 20-016-00139).
Ang artikulo ay nai-publish sa journal na "Protection Protection Bulletin", 2020, 103 (3)